اندوتوکسین چیست و چرا تشخیص آن حیاتی است؟

تعریف علمی اندوتوکسین (Endotoxin Definition)

اندوتوکسین‌ها (Endotoxins) ترکیبات پیچیده‌ای از لیپوپلی‌ساکاریدها (LPS) هستند که در دیواره خارجی باکتری‌های گرم منفی (Gram-negative bacteria) وجود دارند. این مولکول‌ها پس از مرگ یا لیز شدن باکتری آزاد شده و وارد محیط می‌شوند.
اندوتوکسین‌ها به‌عنوان یکی از مهم‌ترین پیروژن‌ها (Pyrogens) شناخته می‌شوند، زیرا حتی در غلظت‌های بسیار پایین می‌توانند در بدن انسان باعث تب، التهاب، شوک سپتیک و واکنش‌های خطرناک سیستم ایمنی شوند.

از آنجا که این ترکیبات بسیار پایدارند و با حرارت معمولی یا اتوکلاو به‌طور کامل از بین نمی‌روند، شناسایی و حذف آن‌ها در فرایند تولید دارو، واکسن و تجهیزات تزریقی ضروری است.

اهمیت شناسایی اندوتوکسین در صنایع دارویی و بیولوژیک

در فرآیند تولید محصولات تزریقی، واکسن‌ها، محلول‌های شست‌وشوی استریل، سرم‌ها و تجهیزات پزشکی، وجود اندوتوکسین می‌تواند سلامت بیمار را به‌شدت تهدید کند.
تشخیص به‌موقع اندوتوکسین به کمک کیت‌های تشخیص اندوتوکسین (Endotoxin Detection Kits) و آزمون‌های LAL (Limulus Amebocyte Lysate) بخش حیاتی از کنترل کیفیت دارویی (Pharmaceutical Quality Control) است.

سازمان‌های بین‌المللی از جمله FDA، USP <85>، EP 2.6.14 و JP 4.01 انجام آزمایش اندوتوکسین را برای تمامی محصولات تزریقی اجباری اعلام کرده‌اند.

منابع احتمالی آلودگی اندوتوکسینی

اندوتوکسین‌ها می‌توانند از منابع مختلفی وارد خطوط تولید و آزمایش شوند، از جمله:

• آب فرآیندی و آب تزریقی (WFI) در صورت عدم فیلتراسیون یا استریلیزاسیون مناسب
• ظروف و لوازم آزمایشگاهی آلوده به LPS
• مواد اولیه بیولوژیکی یا کشت سلولی
• تجهیزات تولید بدون تمیزکاری معتبر (CIP/SIP)
• محیط کار غیر استریل یا بدون کنترل ذرات معلق (Cleanroom Class A/B)

به همین دلیل در تمامی مراحل باید از آب فاقد اندوتوکسین (LAL Reagent Water)، ظروف endotoxin-free و فیلتراسیون دقیق با تخلخل 0.22 µm استفاده شود.

روش‌های تشخیص اندوتوکسین (Endotoxin Testing Methods)

آزمون LAL Test (Limulus Amebocyte Lysate) متداول‌ترین و قابل‌اعتمادترین روش برای شناسایی اندوتوکسین است. این آزمون بر واکنش طبیعی سلول‌های آمیبوسیتی خرچنگ نعل‌اسبی در حضور LPS استوار است.
سه روش اصلی این آزمون شامل موارد زیر است:

1. روش ژل کلات (Gel-Clot LAL Test)
   • روش کلاسیک و کیفی (Qualitative)
   • حساسیت بالا، مناسب برای کنترل نهایی محصولات تزریقی
   • ساده، بدون نیاز به تجهیزات پیشرفته
2. روش کروموژنیک اندپوینت (Chromogenic End-point LAL Test)
   • مبتنی بر واکنش آنزیمی و تغییر رنگ
   • اندازه‌گیری کمی (Quantitative) غلظت اندوتوکسین
   • مناسب برای کنترل فرآیند و آزمایش‌های تحقیقاتی
3. روش توربیدیمتریک (Turbidimetric LAL Test)
   • اندازه‌گیری افزایش کدورت در اثر تشکیل ژل
   • قابلیت استفاده در سیستم‌های خودکار (Automated Endotoxin Test Systems)
   • سرعت بالا و تکرارپذیری عالی
   • محدوده مجاز اندوتوکسین (Endotoxin Limit) بر اساس استانداردهای دارویی
     طبق استانداردهای USP و EP، حداکثر مقدار مجاز اندوتوکسین در محصولات مختلف عبارت است از:
     محلول‌های تزریقی داخل وریدی 5 EU/kg/hour
     محصولات چشمی (Ophthalmic) 0.2 EU/mL
     وسایل پزشکی قابل کاشت ≤ 20 EU/device
     محلول‌های دیالیز و همودیالیز < 0.25 EU/mL
   • (EU = Endotoxin Unit، واحد اندازه‌گیری اندوتوکسین بر اساس فعالیت بیولوژیکی)
   • برندهای معتبر تولیدکننده کیت و تجهیزات تشخیص اندوتوکسین
   • در حال حاضر، شرکت‌های بین‌المللی زیر از تولیدکنندگان پیشرو در زمینه کیت‌های تشخیص اندوتوکسین و تجهیزات LAL هستند:
   • Charles River Laboratories – تولیدکننده کیت‌های اندوسیف Endosafe® و تجهیزات تست سریع
   • Lonza – تولیدکننده PyroGene™ Recombinant Factor C assay
   • Wako Fujifilm – عرضه‌کننده کیت‌های Toxinometer®
   • GenScript – ارائه‌دهنده کیت‌های اندوتوکسین نوترکیب با حساسیت بالا
   • Merck Millipore و Sigma-Aldrich – تولید آب، فیلتر و لوازم Endotoxin-Free
   • تجهیزات و مواد جانبی مورد نیاز برای آزمون اندوتوکسین
   • برای اطمینان از نتایج دقیق و معتبر، باید از تجهیزات و مواد تاییدشده استفاده شود، از جمله:
   • LAL Reagent Water (آب فاقد اندوتوکسین)
   • Pyrogen-free Glassware و Microplates
   • Endotoxin Standard Control (CSE/Control Standard Endotoxin)
   • دستگاه Reader یا Incubator با کنترل دمای دقیق (37 ± 1°C)
   • فیلتراسیون نهایی با فیلتر 0.22 µm از برندهای معتبر (PALL, Cobetter, Millipore)
   •  
   • جمع‌بندی
   • اندوتوکسین یکی از خطرناک‌ترین آلودگی‌های میکروبی در محصولات تزریقی و دارویی است. تشخیص دقیق آن با استفاده از کیت‌های استاندارد LAL و تجهیزات تخصصی، تضمین‌کننده سلامت بیماران و کیفیت نهایی محصولات دارویی است.
   • در صنعت داروسازی امروز، همکاری با تأمین‌کنندگان معتبر و استفاده از برندهای شناخته‌شده در زمینه کیت‌های اندوتوکسین (مانند Charles River، Lonza، Wako، GenScript و Merck) گامی ضروری برای انطباق با الزامات بین‌المللی GMP و افزایش اعتماد مشتریان محسوب می‌شود.